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红江橙脱毒种苗的培育技术 与规模化生产技术体系建设

  • 责任编辑:曹悦
  • 发布时间:2020-04-17 23:15:41
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揭 进1  姚雷业1  刘建荣1  庞 生1  文尚华2  赵丽宏1 张曼其1  刘伟清1  廖积贤1  胡小忠1  陈东俊1 

(1广东省湛江农垦科学研究所  广东湛江  524086 2广东省湛江农垦局  广东湛江  524022)


摘  要:总结了红江橙的株系选育、脱毒处理、原种圃建立、采穗圃建立、育苗圃建 立和病毒检测等环节的研究技术,以及开展规模生产技术体系建设的探索和实践经验,探 讨出全套脱毒种苗培育技术和建成年规模 50 万株以上的红江橙脱毒种苗生产基地的方法, 旨在为我国红江橙产业发展提供优质脱毒种苗的技术支撑。 

关键词:红江橙;脱毒种苗;规模化;技术体系建设



红江橙是广东湛江农垦的特色和名优产品,其具 有果大形好,皮薄光滑,果肉橙红,肉质柔嫩,多汁 化渣,甜酸适中,风味独特等特点,是我国的名牌农 产品,在国内被誉为“人间仙桃”“国宴佳果”,在 国外则被冠为“中国橙王”,因其独特的外观和品质 而具有较强的竞争力。 但是,因黄龙病不断发生与传播,造成红江橙植 株大面积死亡,严重制约了红江橙产业的发展。据调 查,2017 年广东红江农场红江橙疑似黄龙病发生率平 均达到 33%,实际感染黄龙病率平均达到 26%,可见 其危害极大。 柑桔黄龙病(Huanglongbing,HLB)是一种具有 毁灭性的病毒病,传播蔓延迅速,且现有的柑桔栽培 品种都能感病。病菌主要通过带病苗木、带病接穗及 虫媒木虱进行传播,目前对染病树体仍没有合适的药 物治疗方法,只能采用挖除焚烧的方法解决[1]。推广应用无毒健壮的红江橙种苗,是从根源上防治黄龙病 的一条重要途径。 2002年起,广东省湛江农垦科学研究所(以下简 称“科研所”)根据国家农业行业标准,探讨出全套 红江橙脱毒种苗的培育技术,即先通过“热处理+茎 尖微嫁接+PCR检测”技术建立良种红江橙脱毒原种 圃与采穗圃,再选育经温热法脱毒处理的江西红桔 种子作砧木,嫁接培育脱毒红江橙良种种苗[2],并逐 步开展规模化生产技术体系建设工作,取得了良好、成效。


1 红江橙脱毒种苗的培育技术 

1.1 脱毒原种培育和建立原种圃 选择具有优良园艺性状品种的单株作为母树,对 母株带毒状况进行鉴定,通过热处理+茎尖微嫁接技 术培育脱毒原种(不带黄龙病、衰退病、裂皮病和碎叶病),再用 PCR检测技术进行鉴定。同时,建设钢 管结构、用40目防虫网密闭的大棚,门口须设缓冲 区,将脱毒种苗种植在棚内,建立原种圃。种植前要 先对棚内土壤或基质进行彻底消毒,植后加强管理, 并定期对红江橙脱毒原种进行检测[2]。 


1.2 建立采穗圃 采穗圃同样要建立与原种圃一样的大棚,棚面积 大小据育苗规模而定,可按每株母树每年提供300个 芽来推算。母树要按品种(品系)株系分开定植,定 植密度为(1~1.5)m×1m。管理措施以促进营养生 长为主,目的在于培养较多充实健壮的接穗。植后第2年开始采集接穗,可连续使用3年[3]。采穗圃的母 株苗采用脱毒红桔种子苗为砧木、脱毒原种的枝条为 接穗,且经嫁接培育和PCR检测不带病毒的种苗。母 株苗种植前,同样要先对棚内土壤或基质进行彻底消 毒。植后做好管理、维护和定期检测工作。 培育优质芽条是提高嫁接成活率的关键。要根 据嫁接期来确定母树放梢时间,要求秋芽用于翌年春 接,夏芽用于秋冬接。春芽一般从抽芽到转绿老熟要 40d,夏芽要35d,秋芽要50d。 

1.3 建立脱毒育苗圃 

1.3.1  培育砧木苗 


1.3.1.1 苗床准备。采用无污染心土(表土层 30cm以下)与干净河沙配比为6∶4,充分混合, 使用0.5cm的筛孔过筛,再将过筛土堆成 30~ 35 cm高的土堆,用黑色聚光地膜盖好,密封2~ 3 个月自然消毒。播种前亩施优质生物有机肥400~ 600kg、磷肥 100kg,深翻土地,平整作畦,按畦面 高0.3 m、宽0.9~1.1m、长15~20m整理成苗床, 淋0.1%KMnO4 液消毒[4]。 


1.3.1.2 选种。采自无病果园且经检测确认无病 毒的新鲜、饱满、一致性好的江西红桔种子作砧木 种子。 


1.3.1.3 种子处理。种子用纱网装好,用50~ 52 ℃热水预热5~6min,再置于55~56℃恒温水 中浸50min,然后将种子取出沥干水,再用0.1%KMnO4液浸泡10min,取出晾干后播种[2,4]。 


1.3.1.4 播种时间。播种时间一般选择春季播种, 种子易发芽。一般于 1—2月播种,4—6月移苗,10— 12 月可达到砧木粗 0.5~0.8cm的嫁接要求[3]。 


1.3.1.5 播种方式。播种方式有地床式和穴盘 式2种。地床式播种方法可条播或撒播,将种子均匀播在整好的畦面,下种量控制在11kg/亩(约可培 育6.5 万株苗)。播后在畦面上,覆盖一层薄泥,刚 盖过种子即可,再盖上一层发酵过的蔗渣保湿。之后 淋透1500倍多菌灵液,用小型拱棚和薄膜覆盖,保湿 催芽,再视天气情况揭膜透气和酌情淋水。穴盘式播 种方法的基质采用泥炭土与椰糠的比例为4∶1配制 而成,在穴深7cm的50孔穴盘提前装好基质,1个 穴播种1粒种子,播后用基质覆盖好种子,摆放到温室大棚中,淋透1500倍多菌灵液,之后保持基质湿润。穴盘式的优点主要是较地床式出苗快8~15d, 出苗率高31%,育苗时间缩短0.5~1.5个月,且栽后 没有恢复期(地床式恢复期为 7~10 d),光照、温 湿度等培养条件容易控制,病虫害发生少。 


1.3.1.6 播种后管理。播种后每天观测土壤湿度 和温度,视情况适当淋水,及时除草。注意防治猝倒 病,主要措施有:控制好苗床温度,防止高温高湿; 用甲霜灵1000倍液和代森锰锌1000倍液每隔15d轮 换喷施;合理施肥,当苗高5cm时,及时追肥,宜淋施2%~3%复合肥溶液,不偏施氮肥。砧木苗一般 生长2~3个月,高度达15cm、抽叶5~8片时即可 移栽。砧木幼苗出圃前,要充分浇水,分级出圃,蘸 泥浆待栽[3]。 


1.3.1.7 移栽及管理。移栽时,将砧木苗拨起,按 大小分级,剔除劣、弱病苗,再移植到嫁接苗圃苗床 或上袋。移栽苗床或袋苗都必须搭建网室防虫。 移栽采用的营养土一般要提前1~3个月配制, 浇透发酵。营养土宜采用无污染心土,混入优质有机 肥10kg/m3、过磷酸钙5kg/m3。之后按长10~15 m、 宽1m、深30cm的规格整理成苗床,或将营养土装入 规格为直径8cm、高25cm的育苗袋中,并摆放到网 室中。摆放株距以 2~3袋为宜,以利于嫁接操作、病 虫防治和培育壮苗。移栽前 3~6d充分浇水,让营养土吸足水分。苗床移栽按10cm×25cm规格移植,袋 苗移栽则将苗直接栽入泥袋中,1袋种植 1 株。移植 时苗根要与土充分接触,主根不能弯曲,过长根可 适当短截。栽后立即淋定根水,及时扶正浇水时被 水冲斜的幼苗[5]。栽后及时查苗补缺、除草,剪除侧 枝。抽叶后每隔 10~15d追施芬兰复合肥 1 次(5~ 7粒/株)。注意防治潜叶蛾、弄蝶、红蜘蛛,及炭疽 病和根腐病,在每梢抽出 1~2cm时,喷施克蛾宝、 氯氰菊酯、克螨特、百菌清和甲霜灵等药剂预防。经5~6个月培育,苗木主干粗达 0.4~0.7cm、苗高30~40cm时,便可嫁接。


1.3.2 嫁接与管理


1.3.2.1接穗的采集与处理。从无病毒采穗圃采集,选取充实、健壮的枝条剪下,摘去叶片,按株系分扎成捆,用湿布包好,并登记母本树株系名称(编号)和采集时间。嫁接前,选用的接穗用1000倍盐酸四环素液浸泡2h,取出后用清水浸泡待用[6]。


1.3.2.2嫁接与管理。嫁接宜于当年10月至翌年2月进行。嫁接方法采用小芽腹接法,在离地面10~15cm处剪砧,在剪砧口下3~5cm处开接口,然后用嫁接刀从上向下切开皮层,长约1cm左右,切口要平直,有利于使芽片贴合。之后取芽片嵌入砧口,一芽片贴合一砧口,贴合后检查无误就可用薄膜包扎,包扎时薄膜斜线紧贴砧木基部。嫁接后及时除草和砧木萌蘖,检查成活情况并及时补接。注意喷药防病虫害,重点防治溃疡病、碎叶病、衰退病,尤其注意雨季出嫩叶时需防溃疡病;虫害重点防治潜叶蛾、红蜘蛛、蚧壳虫和蚜虫等。可在每次抽新梢时,用克蛾宝15mL+螨危15mL+氯氰菊酯20mL+百菌清30g兑水15kg,5~7d喷施1次,连喷3~4次。嫁接后30~40d,在新梢大部分长至8~12cm并慢慢转绿时,进行解绑,追施2%~3%芬兰复合肥,以后每隔20~30d追肥1次。嫁接后60~90d,苗木抽梢2~3蓬叶并稳定,且苗高40~50cm时,可出圃提供大田种植。出圃前进行各株系嫁接苗的病毒抽检,如检测有病毒应马上销毁该株系的全部嫁接苗。抽检方法为在红江橙嫁接苗生长1~2蓬叶并稳定时,分嫁接批次抽取叶片样,进行PCR检测。出圃时,先把苗床浇透水,再起苗,短途运输可带土运苗,长途运输则抖落营养土,再打泥浆,每50株或100株为一捆,挂牌包装运输。登记苗木去向,便于跟踪调查。


1.4 红江橙脱毒种苗的病毒监测技术从原种圃、采穗圃的建立到育苗圃育苗,再到大田种植管理都要进行病毒防治与监测。一般原种圃、采穗圃母株每年检测2次,育苗圃种苗在每批出圃前抽检1次,大田苗建立监测点并每年抽检1~2次,及时监控和防止黄龙病的发生。检测程序为:采集红江橙的叶片→提取叶片的DNA→PCR扩增→凝胶电泳→通过凝胶成像系统观察实验结果,并拍照保存。


1.4.1 样本采集一般抽取样本叶片检测,专样检测针对目标样本取样,抽样检测则针对目标样抽样,抽取样点的多少视土地面积大小而定,一般取5个/亩,大于1亩小于3亩取7个点,面积再大取样点数也随之增加。取样点位的确定可用“S型法”,即在“S型”上均匀布点。对具体每株树的取样,可在东南西北4个方向各取1~3片叶。取样时,用剪刀剪取叶片(每取一个样用70%酒精消毒剪刀1次),放入干净的封口袋,1个样放1个袋,标上编号、日期、地点、品种和特征等内容。同时,对所采集的样本株挂牌和拍照。


1.4.2 CTAB 法提取 DNA采少量样本叶片,加入液氮迅速研磨成粉,转入2mL的离心管中,加入600μL经65℃预热的2%CTAB缓冲液,65℃水浴45min,期间摇匀;加入600μL氯仿异戊醇混匀,放置10min,12000r/min离心10min,取上清液置于新的1.5mL的离心管中;加入等体积的氯仿异戊醇混匀,2000r/min离心10min,取上清液置于新的1.5mL的离心管中,加入1/10体积3mol/LNaAC(pH值=5.2)和2倍体积的无水乙醇,混匀后放于-20℃冰箱中静置30min以上;之后用4℃离心机设置12000r/min离心10min,弃上清;沉淀分别用冷的70%乙醇和冷无水乙醇各洗1次,室温风干,溶于50μL双蒸水中,-20℃保存。


1.4.3 PCR 扩增Nested-PCR引物根据柑桔黄龙病病原亚洲株系16SrDNA设计。外侧引物(535bp),P2-1:5’TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC3’;P2-2:5’AGAATTCGACTTAATCCCCACCT3’。内侧引物(400bp),P3-1:5’GCGTTCATGTAGAAGTTGTG3’;P3-2:5’CCTACAGGTGGCTGACTCAT3’。PCR扩增程序:95℃预变性5min;94℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸5min。


1.4.4 凝胶电泳及结果判读制备2%琼脂糖凝胶(大胶用60mL,小胶用40mL):称取1.2g(小胶0.8g)琼脂糖置于三角瓶中,加入60mL(小胶40mL)1×TAE,微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,然后加入3μL的goldviewI型核酸染料,即成2%琼脂糖凝胶液。胶板制备:将电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板,将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子,将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层,室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,将凝胶及制胶玻璃板一起放入电泳槽中,添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。加样:在点样板上加入DNA样品或PCR产物的样品,用10μL的移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完1个样品,应更换1个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面(注意:加样前要先记下加样的顺序)。电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60~100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动,电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低,当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。观察照相:电泳完毕后,取出凝胶,在紫外灯下观察,采用凝胶成像系统拍照保存。结果判读:根据PCR扩增产物有无DNA特异扩增条带(即目的片段为400bp)来判断检测的样本里是否含有黄龙病(HLB)的病原菌。PCR为阳性的,说明样本里含有HLB的病原菌;PCR为阴性的,说明样本里没有检测出HLB的病原菌。


2红江橙脱毒种苗规模化生产技术体系建设

2.1 红江橙脱毒种苗繁育技术探索阶段(2002—2013 年)2002年,广东省湛江农垦局、“科研所”和红江农场的有关科技人员,从红江农场鉴选圃中选出红江橙优良株系材料1批,经过热处理脱毒,然后委托中国农业科学院柑桔研究所进行病毒检测,获得不携带黄龙病病原菌的新枝系种质材料18份。同时,从红江农场职工的果园中,通过芽变获得一些红江橙无核(少核)选系,有的经过几代高接仍表现为无核(少核),经过鉴选并获得红江橙优良少籽株系‘K东2’‘A东2’和‘E西2’等[7],于2004年选送少籽红江橙特优株系2个(‘A东2’和‘K东2’)到中国农业科学院柑桔研究所,采取热处理和茎尖微嫁接相结合法进行脱毒培育种苗;于2007年委托中国农业科学院柑桔所成功培育出完全脱毒的茎尖微嫁接种苗,获得不带黄龙病病原及不带衰退病、裂皮病和碎叶病等病毒的2个株系种苗共20株,并分两地保存,其中运回“科研所”15株(‘A东2’9株、‘K东2’6株)。

“科研所”利用上述脱毒种苗在高阳试验基地建立原种圃,再利用原种圃芽条,经过热处理脱毒,嫁接到脱毒砧木上育成脱毒苗,建立采穗圃5亩。原种圃和采穗圃都远离育苗区、大田种植区,采用坚固的网室隔离木虱等昆虫,并配套灌溉设施。同时,“科研所”开展红江橙脱毒种苗的培育技术研究工作,建设脱毒育种圃育苗和种植试验,探索脱毒育苗的全套技术。研究工作得到省部市的财政项目支持,先后获得“红江橙提纯复壮与繁育推广”“红江橙新株系选育与配套栽培技术研究”“红江橙脱毒种苗繁育基地建设”等项目资金支持。2004年,建立了育苗圃25亩,育江西红桔砧木苗60万株,2005年育成达嫁接标准的砧木苗20多万株,并嫁接脱毒红江橙苗19.25万株,成活15.75万株,平均成活率达81.8%,为建立红江橙示范区提供脱毒种苗1.62万株。其中,2004年供给丰收公司0.7万株(建立100亩新株系示范区),供给海南农垦示范种植0.2万株;2007年供给红江农场0.72万株。2010年,培育1.2万株,供给丰收公司0.6万株。2011年培育0.1万株,供给丰收公司试验示范种植0.3万株(50亩)。2012年培育1.2万株,供给红江农场试验示范种植0.5万株(80亩)。2013年培育1万株,供给红江农场0.51万株。


2.2 红江橙脱毒种苗规模化生产技术体系建设阶段(2014—2018 年)2014年,“科研所”开始批量生产红江橙脱毒种苗。2016年新增建立1个采穗圃,种植母树710株(其中少核390株、多核320株),建立了育种圃35亩。2014—2017年,培育砧木苗60万株,脱毒嫁接苗35.6万株,成活30.27万株,平均成活率85%。“科研所”从2012年开始筹建黄龙病检测技术体系,至2014年建成并独立开展工作,截至2017年共检测原种圃、采穗圃母树和育种圃种苗3351个样品,检测湛江农垦农场种植的大田红江橙树247个样品,为红江橙脱毒种苗繁育技术体系建设起到了很好的监控作用。经过15年的努力,“科研所”与中国农业科学院柑桔研究所合作,成功脱毒和隔离保护了一批红江橙优良种质资源,建立了全套红江橙脱毒种苗繁育技术体系,并建成年规模50万株以上的生产技术体系。这为源头上防止红江橙黄龙病的发生,实现红江橙特色产业的壮大提供了优质种苗和技术保证。


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截至2018年8月,“科研所”累计出圃(销售)红江橙脱毒种苗32.12万株,主要供给湛江农垦的红江农场、广垦(湛江)红江橙农业科技有限公司、丰收糖业公司等单位以及广西、海南、广东廉江市等地示范、推广种植,供应垦区内外种植0.5万亩以上(表1),有力地推动了红江橙产业的发展。

红江橙培育技术日趋成熟,种苗得到国内市场充分认可,尤其2016年以来,红江橙脱毒种苗销量很大,种苗供不应求。


3讨论


红江橙脱毒种苗从砧木播种到苗木出圃一般需要12~14个月时间,而在气温较高的巴西圣保罗州,柑桔脱毒种苗培育从砧木播种到苗木出圃一般只需11个月,即播种后3个月移砧,再3个月后嫁接,嫁接后3个月摘心[8]。如何创新和进一步提高育苗技术,缩短育苗时间,加快育苗进程,从而更好更快地为红江橙产业的持续、健康发展提供优质种苗,有待下一步研究。红江橙脱毒种苗的嫁接时间相对集中在10月至翌年2月,经常会出现集中嫁接期与采穗期不对应或接穗供应不足的矛盾。为了解决这个问题,需要开展接穗冷藏技术研究。为了缩短红江橙非生产期和减少病源,实现有效投产期延长,大幅度提高红江橙产业的整体效益,应加大力度引进试验示范和推广中国农业科学院柑桔脱毒大苗繁育应用技术及经验。


参考文献

[1] 何源委,伍兴甲,何懿平.柑桔黄龙病及其控防对策[J].湖南 农业科学,2015(1):34-36,39

[2] 王玉英,高新一.植物组织培养技术手册[M].北京:金盾 出版社,2006

[3] 朱彪,李妍程,杨良民.柑桔工厂化无病毒容器育苗技术 规程[J].现代园艺,2006(8):17-18

[4] 庞生,李强有,张曼其.江西红桔砧木春播与红江橙嫁接 育苗技术[J].现代农业科技,2016(12):94-95

[5] 李太盛,周常勇,陈洪明.苗床柑桔脱毒苗的培育技术研究[J]. 中国南方果树,2010(3):23-24

[6] 钟海强.柑桔黄龙病传播源与防治方法[J].现代园艺, 2016(6):140-141

[7] 张青闪,何永睿,文尚华,等.红江橙无核(少核)选系的细胞 遗传学初步研究[J].西南农业大学学报(自然科学版), 2016(6):937-940

[8] 周宏光,张德才,毛祖法,等.巴西柑桔考察报告[J].中国 南方果树,2003,32(5):20-26